В начале IV тысячелетия до н. э. в Нижней Месопотамии появляется новый народ — шумеры. Вопрос об их прародине до сих пор вызывает споры. Существует шумерский миф о происхождении человечества с о-ва Дильмун (совр. Бахрейн), но не ясно, отражает ли он исторические воспоминания шумеров об их перемещении в Месопотамию. В любом случае, шумерская идеограмма со значением «страна», представляющая собой вершины трех гор, явно свидетельствует о том, что шумеры не были автохтонами в равнинной Нижней Месопотамии.
С приходом шумеров культура Убейд сменилась урукской (IV тысячелетие до н. э.). Шумеры смешивались с местным населением и ассимилировали его, перенимая у него материальную культуру вместе с соответствующими обозначениями. На это указывает нешумерская лексика, например слова, по структуре сходные с banana: zababa, hubaba (теонимы) и тому подобные, которые относят к уже упоминавшемуся «банановому» субстрату. Шумерское общество эпохи Урук — это племенной союз с центром в Ниппуре. Вторая половина IV тысячелетия до н. э. характеризуется внешней экспансией шумеров, созданием колоний (они перестают функционировать в конце IV тысячелетия, в эпоху Джемдет-Наср) и, что особенно важно, возникновением пиктографического письма, которое со временем развивается в словеснослоговое. Раннединастический период шумерской истории завершается в начале III тысячелетия до н. э. разрушительным наводнением — прообразом всемирного потопа, а уже во второй четверти III тысячелетия рядом с шумерами обнаруживаются семитские этносы (восточные семиты — аккадцы). Восточные семиты, которые, как полагают, осели в Междуречье (по крайней мере, в Верхней Месопотамии и на севере Нижней Месопотамии) уже в эпоху неолита, усвоили более высокую шумерскую культуру, и к середине III тысячелетия население Нижней Месопотамии было, вероятно, двуязычным. Его самоназвание — SAĜ.ĜI.GA (букв, «черноголовые»), а этническая идентификация основывалась, как принято считать, на ритуально-языковых признаках (принадлежности к общине шумеро-аккадских божеств).
Очевидно, что в формировании месопотамской цивилизации на ранней стадии принимали участие различные этносы, из которых наиболее значительными были шумеры и восточные семиты (аккадцы). В III тысячелетии семитское (или шумеро-семитское) население занимало всю долину Евфрата вплоть до Сирии. Однако среди личных имен в архивах Эблы (торгового города-государства середины III тысячелетия в Сирии, совр. Телль-Мардих) выявлены не-семитские («протоевфратские»?) имена.
Вклад шумеров в материальную и духовную культуру огромен. Ими были изобретены сложные ирригационные системы, сельскохозяйственные орудия, гончарный круг, в области науки заложены основы астрономии, разработаны система метрологии и счетные таблицы, в религии впервые создан структурированный пантеон. К шумерам восходят первые литературные произведения (например, эпос о Гильгамеше), новые архитектурные формы и многое другое. Шумеро-аккадское культурное наследие, которое развивалось и обогащалось в последующие столетия, оказывало разностороннее влияние на цивилизационные процессы древней Анатолии и сопредельных регионов.
Среди менее значимых этнических групп, проникавших в Междуречье к концу III тысячелетия до н. э., были кутии (племена, населявшие западную область Иранского нагорья и захватившие немалую часть Месопотамии в XXII в. до н. э.; предположительно — родственный тохарам индоевропейский этнос: Т.В. Гамкрелидзе, Вяч. Вс. Иванов), луллубеи, обитавшие в горах Загроса, а также различные кочевые и полукочевые западносемитские племена, однако их воздействие на месопотамскую культуру минимально.
Иначе обстояло дело с западносемитскими амореями, продвижение которых в Месопотамию с запада в конце III тысячелетия до н. э. носило массовый характер. В это время в Нижней Месопотамии происходила этническая трансформация, завершившаяся в старовавилонский период (первые века II тысячелетия до н. э.): шумеры были ассимилированы аккадцами, а шумерский язык стал языком ученых и использовался в ограниченных сферах (в частности в культе). С приходом амореев в городах появляются аморейские династии, из которых самая известная — 1-я вавилонская и ее шестой царь — Хаммурапи (первая половина XVIII в. до н. э.); Южная Месопотамия объединяется в единое государство — Вавилонию. Интересно, что амореи, оказавшись в более высокой по уровню культуры городской среде Месопотамии, сумели сохранить свою этническую идентичность и не были полностью аккадизированы.