После I съезда Всероссийского железнодорожного союза завершилось объединение работников Харьковского узла. Здесь был образован Южнорусский профессиональный железнодорожный союз. С июня 1905 года начал действовать нелегальный союз рабочих и служащих Екатерининской железной дороги. Профсоюзы Харьковского узла и Екатерининской дороги, как и Юго-Западный отдел, вошли в состав Всероссийского железнодорожного союза.
Профсоюзы железнодорожников Украины приняли участие во II съезде Всероссийского железнодорожного союза, состоявшегося в Москве в июле 1905 года и приведшего к его расколу. От Всероссийского железнодорожного союза отмежевался Южно-русский профессиональный железнодорожный союз, установивший организационную связь с союзом железнодорожных служащих Московского узла.
Осенью 1905 года первая российская революция вступила в период высшего подъема, обусловившего дальнейший рост профсоюзного движения и усиление тенденций к его централизации.
Инициатором всероссийского объединения профессиональных союзов выступили профсоюзы Харькова. Состоявшееся в начале сентября 1905 года совещание харьковских профсоюзов избрало первый в России межсоюзный руководящий орган — Центральное бюро профессиональных союзов (ЦБПС), поставив перед ним задачу содействовать развитию профсоюзов в городе и его окрестностях. Харьковское и Петербургское региональные ЦБПС установили связь с профсоюзами Москвы и других городов, определили место проведения и повестку дня будущего съезда или конференции.
I Всероссийская конференция профессиональных союзов прошла 6 октября 1905 года. Ее делегаты высказались за всемерное развитие и укрепление профсоюзов как массовых рабочих организаций.
В это время в Москве началась всеобщая забастовка. Первыми ее поддержали рабочие и служащие Московско — Казанской железной дороги. Затем стачку объявили рабочие и служащие других железных дорог. 11 октября 1905 года бастовало 14 дорог, а к 17 октября стачка приобрела всероссийский размах. В ней приняли активное участие рабочие и служащие Юго-Западной, Екатерининской, Харьково — Николаевской, Курско — Харьково — Севастопольской, Юго-Восточной и других железных дорог.
Октябрьская всероссийская стачка дала новый импульс массовому профессиональному движению, ускорила создание в Украине новых организаций профсоюза железнодорожников. В октябре-ноябре дорожные и местные отделения Всероссийского союза железнодорожников образовались на Курско — Харьково — Севастопольской, Харьково — Николаевской, Киево — Полтавской и других дорогах.
Рабочее движение во главе с профсоюзами наиболее активно проявило себя во время декабрьской политической стачки и вооруженного восстания в Москве. Забастовка охватила все железные дороги и промышленные центры Украины. 8 декабря была объявлена политическая стачка на Екатерининской железной дороге.
В ряде городов на линиях Харьково — Николаевской, Курско — Харьково — Севастопольской, Юго-Западной и других дорог политической стачкой руководили Советы и созданные при участии профсоюзов забастовочные комитеты. В Харькове был образован стачечный комитет рабочих и служащих Курско — Харьково — Севастопольской дороги. 9 декабря забастовали рабочие Харьково — Николаевской дороги. Союз железнодорожников образовал временное управление, которому подчинялись забастовочные комитеты в Полтаве, Лозовой, Знаменке, Николаеве и на других станциях.
После поражения декабрьского вооруженного восстания начался период спада революционного движения. Прекратилась деятельность большинства организации железнодорожного и почтово-телеграфного союзов. Часть профсоюзов, не успев окрепнуть, распалась, часть перешла на нелегальное положение. Но и в этих условиях по мере оживления рабочего движения профсоюзы возобновляли свою деятельность.
Убедившись в невозможности подавить профсоюзы, власти решили изменить тактику — перевести союзы в «законное» русло легальных, ограниченных жесткими правилами подконтрольных организаций. С этой целью правительство активизировало начатую ранее разработку так называемых «Временных правил о профсоюзных обществах», которые были утверждены 4 марта 1906 года. «Временными правилами», или законом от 4 марта 1906 года, прежде всего ограничивался круг рабочих и служащих, которым разрешалось объединяться в союзы. Этой возможности были лишены, в частности, железнодорожники.
В декабре 1906 года делегаты профсоюзов Харьково — Николаевской, Курско — Харьково — Севастопольской и Екатерининской дорог приняли участие в III съезде Всероссийского железнодорожного союза, нелегально проходившем в финском городе Таммерфорсе. Центральным на съезде был вопрос о пересмотре платформы Союза. Съезд принял платформу, ограничивающую классовую борьбу железнодорожников рамками экономических требований в пределах железнодорожной корпорации.