Трудность таких исследований заключалась в том, что комплексы синтетических полиоснований и поликислот с белками, возникающие в условиях опыта in vitro, оказываются крайне неустойчивыми при физиологических значениях рН и ионной силы и, естественно, разрушаются при введении в организм. Поэтому химики (Кабанов и Мустафаев) задались целью синтезировать такие полимеры, которые формировали бы устойчивые комплексы с белками, не разрушающиеся в условиях живого организма, и одновременно обладали бы всеми иммуностимулирующими свойствами описанных выше полиэлектролитов. Задача была решена следующим путем. Цепочки поли-4-винилпиридина нагрузили боковыми радикалами, которые обеспечили возникновение прочных связей с белковыми макромолекулами. Эти радикалы представлены углеводородными группами.
Выявилась интересная закономерность: если число атомов углерода в этих радикалах ниже 10, то они образуют комплексы с белком за счет электростатических связей. Эти связи слабые и разрушаются в условиях организма. Достаточно прочные гидрофобные (водоотталкивающие) связи с глобулами белка обеспечивают радикалы, в которых число атомов углерода равно или больше 10. Комплексы белка с полиэлектролитами, несущими гидрофобные радикалы, отличаются прочностью и не распадаются при введении в организм. Следует отметить, что чем больше атомов углерода в боковых радикалах, тем сильнее взаимодействие между полиэлектролитом и гидрофобными участками белковых молекул.
Сборка антигенов на полиэлектролитах
Итак, "неприродные" полиэлектролиты активно влияют на иммунитет. Введение животным чисто синтетических полианионных или поликатионных соединений усиливает отдельные этапы иммуногенеза. В конечном итоге эти соединения интенсифицируют иммунный ответ. Естественно, возникла мысль, о которой мы уже говорили: если слабый антиген присоединить к макромолекуле полимера, стимулирующего выработку антител и обеспечивающего тимуснезависимость, то такая "комбинированная" молекула должна идеально сочетать в себе как антигенную специфичность, так и стимулирующие свойства. Не путь ли это к проблеме создания "суперантигенов"?
Была предпринята попытка создания такого искусственного синтетического антигена на основе макромолекулы поли-4-винилпиридина.
В качестве антигенной детерминанты при этом было использовано простое химическое соединение — тринитрофенильная группировка. Вещества типа тринитрофенила называются гаптенами. Сами стимулировать иммунный ответ, то есть выработку антител, они не могут, пока не присоединятся к белку или другой природной макромолекуле. Мы присоединили тринитрофенильную группировку к "неприродной" молекуле поли-4-винилпиридина. И получили антиген с поразительными свойствами! Легко удалось выработать антитела против гаптена, присоединенного к очень простому полимерному соединению.
Обычно антитела к гаптену на природных носителях образуются при условии дополнительной стимуляции организма специальными веществами (так называемыми адъювантами). При иммунизации же гаптеном, введенным в молекулу поли-4-винилпиридина, такая стимуляция не требуется. И наконец, выработка антител против синтезированного нами антигена, как оказалось, не зависит от тимуса, в Т-клетках не нуждается.
Иммунизированные синтетическим антигеном Т-дефицитные животные вырабатывают такое же количество антител или даже больше, чем здоровые. При иммунизации тем же самым гаптеном, введенным не в поли-4-винилпиридиновую молекулу, а в молекулу белка, Т-дефицитные животные без дополнительной стимуляции их адъювантами антител не образуют.
В последующих работах в качестве модельного антигена использовали бычий сывороточный альбумин (БСА). БСА — весьма слабый антиген, вызывает иммунный ответ только после многократных иммунизации животных при условии дополнительной стимуляции адъювантами. Ожидалось, что присоединение БСА к молекулам полиэлектролита обеспечит индукцию повышенного иммунного ответа к белковой детерминанте этого искусственного антигена. Искусственные антигены готовили в виде комплекса БСА с поликатионом, возникавшего за счет слабых электростатических или более сильных гидрофобных связей, либо в виде так называемого конъюгата, где БСА ковалентно, наиболее сильно связан с поликатионом.
В качестве полимера-комплексообразователя был выбран сополимер 4-винил-N-этилпиридин и 4-винил-N-цетилпиридин бромидов.