Находясь в Боровском монастыре, Иосиф призвал к иноческой жизни всю свою семью. Постриглись у Пафнутия трое его младших братьев, получив имена Вассиан, Акакий и Елиазар, постригся старик-отец, и ушла в Волоколамскую женскую обитель мать Мария.
В 1476 году скончался отец Иосифа, а год спустя — игумен Пафнутий. Он назначил Иосифа своим преемником, и полномочные старцы отправились к великому князю, чтобы сообщить ему о кончине настоятеля, а также о его последней воле. Великий князь к тому времени уже много слышал о необыкновенно способном и благочестивом иноке. Он утвердил назначение и через месяц Иосиф прибыл в Москву для посвящения.
1 мая 1477 года 37-летний Иосиф был рукоположен митрополитом Геронтием в священники и игумены. Сам Великий князь Иван Васильевич несколько раз принимал у себя Иосифа, угощал обедами, подолгу беседовал с ним, что сразу же поставило Иосифа в ранг лиц, не только приближенных к государю, но и более того — почитаемых им, а таких лиц было в московском княжестве немного. Однако, тогда Иосиф еще не разделял тех взглядов Ивана Васильевича, которые спустя много лет будет поддерживать и укреплять всем свом могущественным авторитетом, — в то время его очень насторожило и даже обеспокоило явное стремление великого князя к единовластию во всем, даже в церковных делах. Он прекрасно понимал, к каким тяжелым последствиям для независимости церкви может привести это стремление.
Вернувшись в монастырь игуменом, Иосиф первым делом собрал всех иноков и объявил, что намерен ввести внутренний распорядок еще более строгий, чем был при Пафнутии. Его поддержали лишь родные братья и еще несколько единомышленников. Все остальные решительно воспротивились. И вот однажды ночью в начале 1478 года игумен Иосиф, да один из самых благочестивых иноков Герасим Черный бесследно исчезли из монастыря. Шли недели, месяцы, а от пропавших не было никаких вестей. Отправились снова полномочные старцы в Москву и сообщили государю о происшедшем, прося дать им нового игумена. Великий князь принял известие, так, будто прекрасно обо всем был осведомлен, все сокрушался, не он ли обидел чем-нибудь благочестивого Иосифа и отпустил старцев обратно ни с чем, точнее с наказом ждать своего игумена, пока он не появится. Он появился ровно через год со дня своего исчезновения и заявил, что обошел много разных обителей, изучая царящие в них нравы и обычаи, после чего еще более укрепился в необходимости ввести в Боровском монастыре самый строгий устав. За время отсутствия игумена сторонников этой идеи не прибавилось, и большинство иноков решительно воспротивились любым нововведениям. Казалось, Иосиф только этого и ждал. Он тут же с необыкновенным смирением заявил, что не желает производить в монастыре раздор, и на следующий же день снова покинул обитель. С ним ушли его братья и четверо верных сподвижников. Как вскоре выяснилось, Иосиф не просто покинул монастырь — он покинул землю, принадлежащую великому князю, и перебрался в Волоколамск под покровительство князя Бориса Волоцкого. Удельный князь и его супруга Ульяна встретили его с большой радостью и почестями, а князь Борис тут же предложил Иосифу выбрать удобное место для основания новой обители. Вскоре Иосиф отыскал такое место. Оно находилось в 13 верстах от Волоколамска между реками Сестрой и Стругой, впадающими в близлежащее озеро, и здесь 6 июля 1479 года был заложен небольшой деревянный храм. При торжественной церемонии закладки присутствовал вместе со всеми своими боярами князь Борис Волоцкий, который и заложил вместе с Иосифом первое бревно в основу будущего храма.