Анастасию тревожные известия поразили как гром среди ясного неба. Страх за сыновей настолько подействовал на нее, что она тяжело занемогла и слегла в жару. В этой сложной для семьи ситуации царь Иван мог надеяться только на расторопность своих слуг, в первую очередь на окольничего Алексея Адашева, своего любимца, который по долгу службы был обязан обеспечивать безопасность и наилучшие условия царской поездки. Однако тот фактически бездействовал, даже не смог достать лекарств для недужной царицы. С трудом Анастасию уложили в одну из повозок, впрягли в нее множество лошадей и отправились в обратный путь. Теперь уже приходилось часто делать остановки, ночевать где попало. Хотя царица и была слаба, но не сдержала гнева в адрес нерадивого Адашева, который не сумел организовать сносный ночлег и достать хорошую еду для ее маленьких сыновей. Тот промолчал, но стал жаловаться придворным на грубость царицы, которой, по его мнению, он не обязан был подчиняться.
Царь также возмутился поведением своего любимца, но больше всего его раздосадовал протопоп Сильвестр. Тот полагал, что лечить Анастасию не следует, ее жизнь и здоровье в руках Божьих, а потому необходимо лишь молить Христа о милости. Хитрый духовник надеялся, что болезнь унесет царицу на тот свет и он наконец-то избавится от ее влияния на Ивана IV.
Только к концу декабря удалось добраться до Москвы. Царицу уложили в теплую постель, вызвали к ней докторов, но долгожданного выздоровления так и не последовало. Возможно, после сильной простуды и нервного перенапряжения у нее началась скоротечная чахотка.
Совсем еще молодая (Анастасии было не больше двадцати восьми лет) и цветущая женщина стала чахнуть буквально на глазах. Все больше и больше она походила на тень, а в июле 1560 года и совсем слегла. В это время стояла сильная жара, дождей давно не было, поэтому, когда на Арбате случился пожар и тучи дыма с искрами полетели к Кремлю, от них тут же вспыхнули деревянные крыши зданий.
Иван Васильевич сам вынес на руках больную Анастасию из дворца, отвез ее и сыновей в Коломенское. Потом вернулся в столицу и лично стал руководить тушением пожара. Вместе с ним знатные бояре и князья доставляли воду, ломали загоревшиеся здания, засыпали землей головешки.
Все попытки спасти умирающую царицу ни к чему не привели. 7 августа в пятом часу дня она преставилась. Современные антропологи исследовали останки Анастасии и пришли к выводу, что она была отравлена. В ее волосах оказалось очень много ртути — почти в пять раз больше нормы. В значительно меньшем количестве ее обнаружили в печени и почках. Сейчас трудно сказать, было ли отравление умышленным. Возможно, ртуть являлась составной частью какой-либо мази, которой растирали тело простуженной царицы. О ядовитых свойствах этого жидкого металла тогда могли просто не знать.
Смерть горячо любимой супруги повергла Ивана Васильевича в огромное горе. Во время похорон «от великого стенания и горести» царь не мог идти сам. Брат Юрий и Владимир Старицкий буквально несли его на руках. Вместе с государем вся Москва оплакивала свою царицу.
Когда гроб с телом усопшей понесли к Вознесенскому монастырю для погребения, то нищие с криком и плачем бросились на землю и запричитали, что лишились своей матери, кормилицы и заступницы. В знак траура по своей любимице они даже отказались от традиционной милостыни. Твердость духа сохранял только митрополит Макарий, но он еще не знал, что в день смерти Анастасии закончилась счастливая полоса царствования Ивана IV. После ее похорон, едва оправившись от потери, он взойдет на престол уже совсем другим человеком — жестоким, мстительным, гневливым и яростным. С этого времени его и станут называть Грозным.
Первыми жертвами грозного царя окажутся его бывшие любимцы: протопоп Сильвестр и Алексей Адашев. Именно их он обвинит в смерти жены и гневно бросит в лицо: «Вы почто меня с женой разлучили, зачем ее очаровали и к гибели привели?» В наказание Сильвестр будет отправлен на покаяние в Кирилло-Белозерский монастырь, а Адашев — на дальнее воеводство в Ливонию, откуда живым уже не вернется.
Со смертью Анастасии царь Иван так больше и не обрел семейного счастья, хотя многократно пытался обрести вторую половину. Через год по совету митрополита и бояр он женился на кабардинской княжне Марии Темрюковне Черкасской. Поначалу юная и горячая горянка даже помогла на время забыть свою первую любовь. Правда, для этого пришлось круто изменить жизнь: переселиться в Александрову слободу, окружить себя преданными опричниками, рубить направо и налево головы и правых, и виноватых. Жизнь с Марией скорее напоминала кромешный ад с дикими оргиями и забавами. Поэтому, когда она умерла, царь испытал не столько горе, сколько облегчение. Третья жена, юная красавица Марфа Собакина, так похожая на Анастасию, не прожила и месяца после свадьбы. Далее, как бледные тени, прошли две Анны: Колтовская и Васильчикова, не оставив в остывшем сердце царя ни малейшего следа. Греховная связь с невенчанной Василисой Мелентьевой была лишь данью природе.