В то же время случилась великая распря святителя Серапиона с игуменом Волоколамского монастыря преподобным Иосифом. Волоколамская обитель находилась тогда в ведении Новгородского владыки. Когда князь Феодор Борисович стал теснить иноков и игумена Иосифа — отнимать монастырские деньги и имущество, приказав ему удалиться, куда угодно, если не желает исполнять княжеские распоряжения, — то святой Иосиф сначала хотел удалиться, а потом по просьбе братии остался и решил просить защиты обители у великого московского князя Василия Иоанновича и у митрополита Симона. Послал он и к владыке Серапиону некоего старца Игнатия за благословением на это дело, но в Новгород по случаю моровой язвы проникнуть было нельзя, и старец воротился назад. Великий князь тоже не сразу принял под свое покровительство Волоколамскую обитель, но сначала пытался уговорить князя Феодора Борисовича, затем в 1507 году собрал собор и по решению соборному принял обитель под свое покровительство, сказавши в успокоение игумену Иосифу: «Ты из предела Новгородской архиепископии не отошел; я взял монастырь твой только от насилия удельного князя, а к архиепископу сам пошлю, как минет земская невзгода».
Когда узнал владыка Серапион о переходе Волоколамской обители к великому князю, то очень огорчился, не принял посланного преподобным Иосифом старца с объяснениями дела и без сношения с великим князем и митрополитом запретил игумена Иосифа в священнослужении и отлучил от Церкви за то, говорилось в грамоте, что «он отступил от небесного, а пришел к земному».
Преподобный Иосиф с покорностью принял гнев святителя, но последние слова неблагословенной грамоты огорчили великого князя и митрополита.
Великий князь тогда же лишил архиепископа престола, вытребовал в Москву и заточил в Андрониевском монастыре. В 1509 году на соборе архипастырей разбиралась между прочим жалоба игумена Иосифа на владыку Серапиона за отлучение от Церкви. Три раза отцы собора спрашивали архиепископа Серапиона, за что он отлучил игумена Иосифа и по каким церковным правилам.
Владыка Серапион ничего не отвечал, говорит летописец. По словам же преподобного Иосифа, архиепископ вместо ответа начал только свариться со всеми, говоря: «Про то я ведаю, почему не благословил Иосифа, а вам какое до того дело? Волен я в своем чернеце, как и князь Феодор в своем монастыре». На вопрос великого князя, за что он назвал князя Феодора небесным, а его земным, Серапион не нашелся ничего сказать. Собор простил и благословил игумена Иосифа, владыке же Серапиону определил пребывать в монастыре.
Долгое время новгородцы не могли утешиться о лишении своего доброго пастыря и учителя. Недолго был он у них, но успел и в короткое время показать себя питателем нищих, наказателем вельмож, утехою скорбящим, прохладою обуреваемым и общим всем помощником. 17 лет у новгородцев не было архиепископа после владыки Серапиона.
Много претерпел святой Серапион в заточении в Андрониевом монастыре. Митрополит перед своею смертью в 1511 году примирился со святым Серапионом, пригласил его в Москву к себе, благословил и сам принял от него прощение. Тогда же последовало примирение с владыкою Серапионом и преподобного Иосифа. Сам великий князь Василий Иоаннович, вспомнив завет своего родителя, смиловался и позволил владыке Серапиону переселиться в Троице-Сергиев монастырь, где он много подвизался в посте, молитве, глубоком смирении и терпении. Перед кончиною своею святой Серапион принял схиму; простившись с братией обители преподобного Сергия и причастившись Святых Тайн, он скончался 16 марта 1516 года со словами на устах: «Господи, в руце Твои предаю дух мой».
Необыкновенною радостью осветилось лицо почившего святителя; со слезами и скорбью погребли иноки владыку Серапиона близ церкви Живоначальной Троицы; святые мощи его обретены нетленными в следующем 1517 году, 7 апреля, и почивают под спудом в Троице-Сергиевой Лавре, на южной стороне Троицкого собора, где прежде была келлия преподобного Сергия.
Бог прославил Своего угодника особым даром чудотворений и прозорливости как при жизни, так и после блаженной его кончины.
Однажды святитель Серапион в праздник Успения Пресвятой Богородицы пригласил к себе на пир старейшин града и множество народа; среди пришедших был один хромой, который ползал много лет на ногах и руках, опираясь на деревяшки. Милостивая душа архиепископа захотела напитать хромого сначала духовною пищею. Святой Серапион со слезами помолился Господу об исцелении больного и сказал хромому: «Во имя Господа Бога и Спаса нашего Иисуса Христа востани на ноги твои!» Хромой поднялся на ноги, подошел к архиепископу и принял от него благословение. Бывшие при этом чуде прославили Бога и его угодника.