К преподобному Иову начали приходить вельможи, просившие духовного окормления. Он стал пользоваться особым доверием и покровительством известного защитника Православия на Волыни князя Константина Острожского. Князь Константин обратился к игумену Угорницкого монастыря с просьбой отпустить преподобного Иова в его княжеский Дубенский Крестный монастырь. Игумен согласился, и через некоторое время преподобный Иов был поставлен во главе Дубенской братии. В сане игумена он пробыл более двадцати лет, к этому времени относятся заключение Брестской унии (1596 г.) и последовавшие притеснения православных. Князь Константин, под защитой которого находился преподобный Иов, имел огромное влияние на Волыни, пользовался уважением польского короля Сигизмунда III и папы римского Климента VIII. Поэтому униаты и иезуиты не решались препятствовать действиям преподобного. Во время пребывания в Дубне святой приступил к распространению православных книг. С этой целью он подвигнул некоторых на переводческую деятельность и переписку книг. По свидетельству жития, преподобный Иов и сам участвовал в этом труде.
По благословению святого в 1581-1582 гг. князь Константин издал в городе Остроге первопечатную славянскую Библию (Острожская Библия). Заботы и волнения, связанные с издательскими трудами, а также неприязнь латинян отвлекали святого Иова от монашеского делания. Поэтому он решил оставить Дубенский монастырь и около 1604 г. поселился в скромной обители неподалеку — на горе Почаевской.
Какой была эта обитель до прихода в нее преподобного Иова? Около 1240 года здесь поселились пустынножители монахи — выходцы из Киево-Печерского монастыря. Они покинули Киев, спасаясь от нашествия полчищ Батыя. В 1340 году в Почаеве совершилось чудесное явление Божией Матери в огненном столпе. До конца XVI века обитель была пустынной: иноки жили в отдельных пещерах и собирались для молитвы в небольшом храме в честь Успения Божией Матери. В 1597 году в обители появилась великая святыня — чудотворная икона Божией Матери, переданная помещицей Анной Гойской (икону подарил Гойской греческий митрополит Неофит, гостивший в ее доме).
Преподобный Иов искал в Почаевской обители безвестности и свободы для молитвы, но иноки, вскоре почувствовавшие в пришельце духовную силу, единодушно и со слезами просили его стать их игуменом. Святой был вынужден уступить, и вскоре его трудами монастырь Почаевский упрочил свое положение и возвысился над прочими западно-русскими обителями. Он стал пользоваться материальной поддержкой местных дворян, избежавших отпадения в унию. Так, в 1649 году на средства помещиков Феодора и Евы Тамашевских в обители был построен каменный храм во имя Пресвятой Троицы, в который был передан запечатленный в камне отпечаток цельбоносной стопы Божией Матери и Ее чудотворная Почаевская икона. Икона была установлена над Царскими вратами, откуда опускалась для верующих, что совершается и доныне. Это был период расцвета монастыря, число иноков в нем сильно возросло. Но вскоре последовали бедствия. В 1607 году на обитель напали татары и, ограбив, убили одного из иноков. В 1620 году внук скончавшейся Гойской, протестант Фирлей, задумал прогнать иноков с Почаевской горы, для чего отобрал у них земельные угодья и, ворвавшись со слугами в монастырь, унес чудотворную икону. После этого дом Фирлея постигли бедствия и болезни, не прекращавшиеся до тех пор, пока икона не была возвращена в монастырь. Эти события побудили преподобного Иова к большим и скорбным трудам. В течение нескольких лет он был принужден сам ездить по судам и конторам, пока, наконец, тяжба с Фирлеем не решилась в пользу монастыря. В результате огромных усилий удалось вырыть на Почаевской горе колодец и тем самым дать обители воду (соседние источники были отобраны Фирлеем).
Особенно важной для укрепления Православия на Волыни была книгоиздательская литературная деятельность преподобного Иова. В начале XVII века в этом крае осталась всего одна славянская типография — Почаевская. Ее-то и использовал преподобный в целях борьбы с иноверием. Здесь печатались книги обличительного и догматического характера, православные молитвы, послания. Долгие годы (по 1932 г.) в Почаевском монастыре хранился труд самого преподобного — «Книга блаженного Иова Почаевского, властною рукою его написанная», содержащая до 80-ти бесед, поучений, проповедей, а также выписки из святоотеческих аскетических и полемических сочинений (издана в 1884 году в Киеве на русском языке под названием «Пчела Почаевская»). Главной для преподобного была борьба с католиками и протестантскими сектами, особенно социнианской, проповедующей монотеизм в иудаистской форме. Социниане ставили Моисеевы книги выше Евангелия, отрицали догматы о Святой Троице, Божестве Иисуса Христа, Приснодевстве Марии. Именно поэтому в книге преподобного Иова эти заблуждения рассмотрены особенно подробно. Преподобный присутствовал на Киевском Соборе 1628 года, состоявшемся в связи с возвращением в Православие отпавшего в унию архиепископа Мелетия Смотрицкого. Преподобный Иов писал соборное определение, свидетельствующее о верности Восточному Православию.